多次的失败往往比单次的失败更容易调查，可以首先从阳性菌的分布来决定进行菌种鉴定，同时对于生产各个环节如空气设备物料。过滤器hEPA等各个角度进行调查。如果是多次失败，要看每次失败的阳性率。对于使用的容器，如西林瓶胶塞还是预充针？这些都需要综合考虑。

建议从两个方面入手调查：1)进行菌种鉴定，评估污染可能来源；2）评估后开展分段无菌灌装，查找污染来源。

建议：做一个调查性的培养基模拟 ，从除菌过滤开始，每一个过程或每下个操作步骤，均取样培养，取较大量的样，最终看在哪一个步骤开始出现阳性结果。这个试验虽然还是有一定的概率性，但可以做为没办法的方法之一去考虑。

答:某公司近来多次培养基灌装失败，培养基灌装模拟了生产灌装工艺，在一隔离器内进行。公司使用的是市售TSB(非无菌的散装粉末)，经0.2um的除菌过滤器过滤制备成无菌溶液。公司展开了调查以追溯污染源。调查使用常规的微生物技术:包括使用选择性培养基(如血液琼脂)和非选择性培养基(如TSB和胰蛋白大豆琼脂)，在显微镜下镜检，仍未成功分离或复原污染生物体。最终通过使用16SrRNA基因序列确认污染物是莱氏无胆甾原体。公司随后进行研究，确认使用的TSB批次中存在莱氏无胆甾原体。因此，不是来自工艺中的污染物而是来自培养基。莱氏无胆甾原体属于支原体的一种。支原体仅含有细胞膜，不含细胞壁。它们对B-内酰胺抗生素不敏感，也不能被革兰氏染色剂染色。个别生物呈现多品型(形状变化多端，从球状到杆状再到丝状)，大小从0.2到0.3rm各异，甚至更小，已显示莱氏无胆甾原体能穿过0.2vm的滤器，但可被0.1m的滤器截留，己知莱氏无胆甾原体与动物衍生原料有关，而且微生物培养基也常常源于动物。支原体环境监
测规定是选择性培养基(PP10肉汤或琼脂)。解决方案:公司决定灌装培养基所用的TSB，通过0.1vm过滤器过滤(注意，我们不是期望或规定公司通常使用0.1um过滤介质对制备的培养基进行过滤)。今后，企业将采用市售的无菌、辐照过的TSB(公司的高压蒸气灭菌器太小，不能处理培养基灌装用的TSB，因此此法不可行)。公司会持续监测支原体并且对清洁验证程序进行重新验证以确认支原体是否去除。这样，公司经过彻底调查找到了失败的原因并且采取了适当的纠正措施。翻译者补充:国内无菌企业应该从这个案例中吸取教训，对于用于APS的培养基来源进行审核控制，以避免类似污染。

翻译者补充:对于大部分清洁验证工作，都需要验证人员努力开发合适的取样方法，来进行全面取样和测试，只取淋洗样品往往会被官方检查人员挑战

----来源各国GMP问答精选